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文|米奇

【资料图】

编辑|米奇

沙门氏菌二氢叶酸还原酶DHFR作为一种重要的催化酶，在细菌细胞中发挥着关键的代谢调节作用。它参与着核苷酸的生物合成途径，通过催化二氢叶酸的还原反应，将二氢叶酸还原为四氢叶酸，这一反应对于细菌的生长和分裂过程至关重要。

近年来，随着越来越多的结构生物学研究的开展，我们对于沙门氏菌DHFR的结构特点有了更深入的了解。这些结构特点不仅揭示了沙门氏菌DHFR的三维构象，还提供了关于其催化机制的重要线索。

那么，我们一起来探索一下沙门氏菌DHFR的结构特点，来探讨它是如何影响氢化物转移和催化活性的。

研究对象

酶利用多种时间尺度上的运动来高效催化反应，虽然我们已经确认较慢的蛋白质运动在某种程度上对催化起到作用，但快速的飞秒-皮秒级动力学对催化的化学步骤的影响仍然存在争议。一些研究报告提出了快速飞秒-皮秒级动力学与催化的化学步骤之间存在耦合关系。

这些运动被认为是远程的，涉及到活性位点以外的氨基酸残基。在过去的15年里，我们已经取得了使用重同位素标记来研究这种快速运动对催化的化学步骤的影响方面的进展。

重同位素标记是通过在基质中引入2H、13C和15N标记来实现的，这些标记物被用于表达酶。重同位素标记被认为不会影响酶的静电性质，相反，它减缓了键之间的振动。因此，重同位素标记和自然同位素的酶之间存在速率常数差异，这被认为是由质量诱导效应导致蛋白质运动减慢所致。

研究酶同位素效应在化学步骤中的动力学耦合可以揭示动力学如何影响催化的化学步骤。

圆二色谱分析和SeDHFR的热展开

对天然丰度和重标记酶进行了圆二色（CD）光谱记录，以确认13C和15N重同位素标记未改变蛋白质的结构元素。轻重两种酶的CD光谱几乎完全重叠，表明同位素标记对结构没有不利影响。两个谱线也具有折叠蛋白的特征，具有在208至222纳米之间的宽谷和在193纳米处的峰，对应α螺旋结构。

通过测量在5至80°C温度范围内208 nm处的平均残基椭圆度的变化来计算天然丰度和重标记的SeDHFR的热熔解温度。

对于天然丰度SeDHFR，在52至61°C之间观察到了二级结构的快速丧失，并计算得到Tm为54.3°C。这与EcDHFR的值相似。在天然丰度和重标记的SeDHFR之间在Tm方面没有显著差异，因此表明同位素标记没有影响酶的热稳定性。

SeDHFR的稳态动力学

SeDHFR催化的反应的稳态速率，是通过使用UV-Vis光谱测量在340 nm处吸光度的降低来测量的，该吸光度变化对应于NADPH的烟酰胺环的氧化。因此，可以使用比尔-兰伯-布尔耶定律计算反应速率，其消光系数为11800 M-1cm-1，对应于酶-底物复合物。

SeDHFR的动力学尚未被表征，在pH 7.0和20°C下测得的SeDHFR的测量kcat值（8.6 ± 0.3 s-1）与在相同温度和pH下测得的EcDHFR的值（12.6 ± 1.4 s-1）相似，尽管稍慢。

然而，在相同条件下，MpDHFR（14.8 ± 0.8 s-1）和BsDHFR（16.2 ± 2.8 s-1）的速率几乎是SeDHFR的两倍。然而，SeDHFR的kcat速率比TmDHFR（0.2 ± 0.02 s-1）在pH 7.0和25°C下要快大约72倍，与其他DHFR一样，稳态转化速率与温度呈指数关系，符合预期的阿伦尼乌斯行为。

SeDHFR催化的反应的活化能（Ea）为61.6 +/- 0.6 kJ mol-1，略高于其他细菌DHFRs报告的值，后两者是热嗜性的。较低的Ea值通常与寒冷嗜好酶相对应，就像MpDHFR一样，因为可用于克服活化能障碍的热能较少。与EcDHFR和BsDHFR一样，SeDHFR的阿伦尼乌斯预指数27.44 ± 0.2 x108 s-1要高得多，而TmDHFR和MpDHFR的值较低。

pH对SeDHFR稳态动力学的影响

DHFR催化的反应不仅将一个氢化物转移给DHF的C6，还催化了DHF的N5位的质子化。改变溶液的pH值将改变活性位点残基的离子化状态以及溶液中可用的质子数量。在20°C下，使用MTEN缓冲液，在pH 5到9的范围内表征了SeDHFR的pH和稳态速率之间的关系。

在较低的pH值下，kcat减小（在pH 9.0时，kcat = 2.94 ± 0.13 s-1），在pH 7.5时达到最大值（12.05 ± 0.08 s-1）。在较高的pH值下，kcat降低至pH 5.0时的5.60 ± 0.08 s-1。SeDHFR和MpDHFR一样，其稳态速率对pH值有依赖关系，形成一个钟形曲线。然而，EcDHFR在较低的pH值下并不表现出明显的稳态速率降低，其曲线为S型。

另外，被认为使MpDHFR能够稳定一个类似封闭构象的突变体MpDHFR-P150S，也被发现与pH呈S型关系，类似于EcDHFR。

然而，突变体EcDHFR-S148P，其中封闭构象的形成不稳定，也表现出S型曲线，然而，在测量的pH范围内，与野生型酶相比，kcat速率降低了约80%。

在EcDHFR的三重突变体中，其中来自人类DHFR的残基被插入αC螺旋，也观察到了钟形pH依赖性。低pH值下kcat的减少被归因于THF在较低pH值下的解离能力较差。因此，这些关系不太可能表示构象行为。

SeDHFR中的产物抑制效应

突变体EcDHFR-S148P，其中封闭构象的形成被削弱，与野生型EcDHFR相比，在NADP+抑制方面显示出巨大的降低约20倍的IC50值。野生型MpDHFR对于NADP+的IC50值比野生型EcDHFR低约5倍。

为此，测量了SeDHFR中NADP+的IC50值，该酶被证明采用了类似于EcDHFR的第二种结构构象。还测量了TmDHFR中NADP+的IC50值，该酶在催化过程中保持固定的开放构象。

SeDHFR的IC50值几乎比野生型EcDHFR高出2倍，比MpDHFR和TmDHFR高出约12倍和6倍，后两者在化学步骤后均不形成封闭构象。这些证据与先前的报告相一致，即在化学步骤后形成封闭构象的能力可以减轻NADP+的产物抑制作用。

在SeDHFR中的氢化物转移

在单次反应条件下测量了氢化物转移速率，反应在292 nm处被激发，并通过400 nm的截止值测量发射。观察到荧光能量传递现象，通过一种被称为Förster共振能量转移（FRET）的机制，在活性位点中的色氨酸残基Trp22与NADPH的烟酰胺环之间进行能量传递。

研究氢化物转移速率常数在DHFR变体的研究中得到了广泛应用，这得益于Trp22在DHFR活性位点中几乎普遍存在。

先前，在pH9的条件下进行了一些停流测量，其中氢化物转移的速率成为速率限制步骤。在如此高的pH值下，动力学主要反映了化学步骤的速率，并且来自其他过程的贡献将被最小化。

然而，在较高的pH值下，酶与其生理pH值明显不同，因此酶的三级结构、构象行为和可离子化残基的质子化状态都会受到影响。因此，在pH 7.0下，对SeDHFR中的氢化物转移进行了在5-40 °C温度范围内的研究。

使用酶制备的NADPD确定了SeDHFR催化的反应的主要KIE，而KIE的值需要使用方程式计算。

在5°C下，主要KIE为2.40±0.06 s-1，并在40°C下略微下降至2.22±0.02 s-1。关于主要KIE的温度依赖性，只能观察到随着温度增加，KIE略有下降的趋势。

已经测量了几种DHFR变体的主要KIE。在5°C下，主要KIE为3.0±0.2，在40°C的温度下降至2.2±0.2。这种温度依赖性的变化表明在高pH值下有不同的动力学过程。

因此得出结论，隧道效应参与了EcDHFR催化的反应的氢化物转移步骤，并且计算实验证明，隧道效应的贡献有效降低了EcDHFR催化的反应的活化能Ea。

蛋白质快速运动在飞秒皮秒时间尺度上对化学步骤的催化作用如何产生影响仍然存在激烈的争议。目前已知TmDHFR是唯一形成二聚体结构的DHFR。在一个嗜热醇脱氢酶中也观察到了这种KIE温度相关性的分界点。有人推测在这种条件下，三个DHFR变体都依赖于酶在化学步骤之前采取反应准备的构象。

酶动力学同位素效应（KIE）和动力学之间的关系

最近，重同位素标记酶已被用作探索酶中快速动力学和催化之间关系的工具。重同位素标记改变了键的振动特性，影响到多个时间尺度上的蛋白质运动，然而，据认为电荷静电作用基本上不受影响，酶的同位素效应（KIE）是使用方程式计算的。

通过在SeDHFR中使用停流技术测量氘转移速率，已经对重同位素标记对SeDHFR催化化学步骤的影响进行了表征。在自然丰度（轻）和重标记的SeDHFR中，测量了氘转移的速率，温度范围为5至40摄氏度。

在5至35摄氏度范围内，自然丰度和重标记的SeDHFR的氘转移速率均呈指数增长。对于自然丰度的SeDHFR，氘转移速率（kH）在测量温度范围内从28.0±0.3 s-1增加到216.1±17.2 s-1。

对于重标记的SeDHFR，氘转移速率kH在测量温度范围内从28.7±0.6 s-1增加到197.5±12.0 s-1。所得的酶KIE在温度上没有明显的依赖性，从5摄氏度的0.96±0.01增加到35摄氏度的0.99±0.04。这表明在SeDHFR中进行重同位素标记对氘转移催化步骤没有显著影响。

在pH 7.0、20摄氏度下，还测量了重同位素标记对稳态催化速率的影响。在这些条件下，测得的酶KIE（kcat）为1.06±0.08，与类似条件下EcDHFR的值相似。另一方面，被认为在构象上受限的突变体EcDHFR-N23PP/S148A在测量温度范围内的酶KIE为1。

因此，SeDHFR中观察到的较小酶KIE很可能是由类似于EcDHFR中观察到的构象行为引起的。在pH 7.0下，酶KIE的温度依赖性。

EcDHFR中的酶KIE在5°C时为0.92 ± 0.04，而在40°C时为1.18 ± 0.09，因此显示出轻微的温度依赖性。计算模拟结果显示，重酶的隧道传输概率没有明显变化。轻酶和重酶之间速率常数的一些差异，被认为是重同位素在环境波动下响应较差的结果。

在EcDHFR催化的反应中，任何促进动力学的影响都不会对氢化物转移的整体速率产生显著影响。事实上，有人提出与反应坐标动力学耦合可能是重酶在较低温度下速率较慢的原因，与生理温度相比。

基于上述研究结果，我们可以得出以下简单结论：

EcDHFR显示出酶KIE的小幅温度依赖性，而TmDHFR和SeDHFR的酶KIE接近于单位，表明它们可能相对更加刚性。

BsDHFR和MpDHFR在较低温度下显示出较大的酶KIE，随着温度升高，酶KIE逐渐接近于单位，这可能与其灵活性和动态行为有关。质量诱导的效应和动态耦合对酶催化过程的影响因DHFR变体而异。